Makroskopická diagnostika
Vzorky fekálií vyšetrujeme najprv makroskopicky, zisťujeme larvy, dospelé štádiá nematódov, články pásomníc, prípadne ektoparazity. Prítomnosť patogénnych organizmov v truse nám môže prezradiť aj jeho farba, konzistencia, poprípade krv alebo hlien nachádzajúci sa v ňom. Podľa konkrétneho vyšetrenia zvolíme ďalšie spracovanie trusu vhodnou metódou na mikroskopické vyšetrenie.
Mikroskopická diagnostika
- Natívny preparát
Natívny preparát pripravíme rozterom trusu o veľkosti obilného zrna v kvapke vody alebo glycerínu. Pomocou natívneho preparátu môžeme sledovať aj prítomnosť rôznych pohyblivých štádií bičíkovcov, nálevníkov alebo meňaviek. Identifikujeme ich na základe typického pohybu, veľkosti, tvaru a povrchových štruktúr. Poprípade náter necháme zaschnúť a následne ho môžeme fixovať vo vhodnom činidle alebo sa farbí rôznymi farbivami.
- Perianálny zoškrab
Používa sa na zistenie oxyuriázy koní a pasalurózy králikov. Zoškrab z kožných perianálnych rias a okolia anusu robíme pomocou tupej drevenej lopatky alebo lyžičky. Ak sa pomôcky pred použitím zvlhčia zmesou glycerínu a vody, vajíčka sa lepšie prilepia. Získaný zoškrab rozotrieme na podložnom sklíčku v kvapke glycerínu, prikryjeme krycím sklíčkom a vyšetrujeme pod mikroskopom.
- Zlep
Využívame v humánnej medicíne na diagnostiku enterobiózy. Lepiacu pásku prilepíme na okolie konečníka, po odlepení od kože priložíme lepiacu pásku na podložné sklíčko a vyšetrujeme pod mikroskopom.
Kvantitatívne koncentračné metódy vyšetrenia fekálií
Tieto metódy sa používajú na zistenie intenzity infekcie ako aj na zistenie efektívnosti niektorých antihelmintík resp. antiprotozoík. Určujeme počet zárodkov (oocýst, vajíčok alebo lariev) v presnom množstve fekálií, zvyčajne v jednom grame.
McMasterova kvantitatívna metóda:
Odvážime 3 g trusu, pridáme 42 ml vody, rozmiešame na suspenziu a prefiltrujeme cez sitko do kadičky. Filtrátom naplníme centrifugačnú skúmavku s objemom 15 ml a rovným dnom. Vzorku centrifugujeme pri 2000 ot./min po dobu dvoch minút. Supernatant zlejeme a k sedimentu pridáme flotačný roztok do pôvodného objemu, t.j. 15 ml. Sediment s flotačným roztokom dobre premiešame a Pasteurovou pipetou naplníme počítacie políčka McMasterovej komôrky. Pod mikroskopom spočítame oocysty, vajíčka alebo larvy jednotlivých druhov parazitov a zvlášť vyjadríme ich počet v 1 g trusujú v jednom alebo oboch políčkach a prepočítava sa na 1g trusu.
Počet väčší ako 1000 na 1g poukazuje na silnú infekciu, počet okolo 500 na 1g na stredne silnú infekciu, ak je nízky počet vajíčok, nemusí to znamenať len slabú infekciu ale aj začínajúcu infekciu alebo vyvíjajúcu sa imunitu.
Špeciálne koprologické metódy – farbiace metódy – sa používajú na diagnostiku cýst a trofozoitov protozoí, a tiež málo kontrastných vajíčok a lariev helmintov:
- Hrubý náter trusu ofarbený podľa Kato – využíva roztok malachitovej zelene
- Náter trusu ofarbený karbolfuchsínom – diagnostika kryptosporídií (oocysty sa javia ako svetloružové útvary na kontrastnom tmavo ružovo-červenom pozadí preparátu
- Náter trusu ofarbený podľa Ziehl-Nielsena – diagnostika kryptosporídií (oocysty sa javia ako výrazne červenkasté subsférické útvary na svetlo zelenom pozadí preparátu
- Náter trusu ofarbený podľa Kinyouna – diagnostika kryptosporídií (oocysty sa javia ako červenkasté subsférické útvary na svetlo modrom pozadí preparátu
Kultivačné larvoskopické metódy – používajú sa na diagnostiku lariev nematódov tráviaceho traktu prežúvavcov a koní; infekčné larvy tretieho štádia L3 gastrointestinálnych červov z triedy Nematoda sa získavajú z koprokultúr. Presnú diagnostiku lariev (L3) robíme podľa vytvorenej kutikuly, počtu črevných buniek a dĺžky chvostového konca lariev. Musí urobiť do 7 dní od kultivácie, pretože po tomto čase strácajú jemné kontúry, ktoré sú potrebné na ich určovanie.
Kvalitatívne koncentračné metódy vyšetrenia fekálií
Týmito metódami skoncentrujeme propagačné štádiá (vajíčka helmintov a oocysty protozoí) buď flotáciou na povrchu tekutiny alebo na dne skúmavky. Tieto metódy sú presnejšie v porovnaní s priamym mikroskopickým vyšetrením.
1. Flotačné metódy
Princípom tejto metódy je rozdielna špecifická hmotnosť vajíčok a flotačného roztoku. Vajíčka s nižšou špecifickou hmotnosťou vyflotujú na povrch flotačného roztoku. Na diagnostiku sa používajú roztoky so špecifickou hmotnosťou v rozpätí 1,10 – 1,30 určené pre cysty protozoí a vajíčka nematód a cestód. Vajíčka trematód sú ťažšie a na ich vyflotovanie sa používajú flotačné roztoky s vyššou špecifickou hmotnosťou 1,30 až 1,35.
Flotačný roztok Kozák-Mágrovej – nasýtený roztok MgSO4, NaCl a glycerínu (šp. hm. 1,24)
Vyšetrované zvieratá: mäsožravce (psy, mačky a iné), vtáky
Diagnostikované parazity: vajíčka a larvy helmintov; protozoa
Postup: 3g trusu roztrieme s 20 ml H₂O v trecej miske na homogénnu suspenziu, prefiltrujeme cez sitko do kadičky a filtrát prelejeme do centrifugačnej skúmavky asi 1cm pod okraj, centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min., supernatant zlejeme a k sedimentu pridáme flotačný roztok Kozák-Mágrovej do 1/3 výšky centrifugačnej skúmavky, premiešame kovovou tyčinkou a centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min.; Parazitologickou kľučkou odoberieme z povrchového prstenca kvapaliny postupne tri kvapky pod sebou alebo vedľa seba na podložné sklíčko.
Flotačný Brezov roztok – nasýtený roztok MgSO4, NaS2O3 a vody (šp. hm. 1,30)
Vyšetrované zvieratá: kone, prežúvavce – malé ( kozy, ovce) a veľké (hovädzí dobytok a vysoká lesná zver), plazy, svine (prasa a diviak), hlodavce, zajace a králiky
Diagnostikované parazity: vajíčka a larvy helmintov; protozoa
Postup: 3g trusu roztrieme s 20 ml H₂O v trecej miske na homogénnu suspenziu, prefiltrujeme cez sitko do kadičky a filtrát prelejeme do centrifugačnej skúmavky asi 1cm pod okraj, centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min., supernatant zlejeme a k sedimentu pridáme flotačný Brezov roztok do 1/3 výšky centrifugačnej skúmavky, premiešame kovovou tyčinkou a centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min.; Parazitologickou kľučkou odoberieme z povrchu kvapaliny postupne tri kvapky pod sebou alebo vedľa seba na podložné sklíčko.
Flotačný Faustov roztok – nasýtený roztok ZnSO4 (šp. hm. 1,18)
Vyšetrované zvieratá: mäsožravce (psy, mačky a iné)
Diagnostikované parazity: protozoa – Giardia spp.
Postup: 3g trusu roztrieme s 20 ml H₂O v trecej miske na homogénnu suspenziu, prefiltrujeme cez sitko do kadičky a filtrát prelejeme do centrifugačnej skúmavky asi 1cm pod okraj, centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min., supernatant zlejeme a k sedimentu pridáme flotačný Faustov roztok do 1/3 výšky centrifugačnej skúmavky, premiešame kovovou tyčinkou a centrifugujeme 2 minúty pri 2500 ot./min.; Parazitologickou kľučkou odoberieme z povrchu kvapaliny postupne tri kvapky do tvaru trojuholníka na podložné sklíčko a prikryjeme krycím sklíčkom.
2. Sedimentačná metóda
Princípom sedimentačných metód je rýchle klesanie ťažkých vajíčok (Trematoda, Acanthocephala) na dno sedimentačnej nádoby v tekutine, ktorá má nižšiu špecifickú hmotnosť (napr. voda).
Vyšetrované zvieratá: vtáky dravce, prežúvavce – malé (kozy, ovce) a veľké (hovädzí dobytok a vysoká lesná zver)
Diagnostikované parazity: vajíčka helmintov
Postup: 3g trusu roztrieme s 20 ml H₂O v trecej miske na homogénnu suspenziu, prefiltrujeme cez sitko do 100 ml sedimentačnej nádoby (kadičky), k filtrátu dolejeme vodu až po okraj nádoby a necháme sedimentovať asi 10 minút. Supernatant opatrne vylejeme do výlevky a k sedimentu do nádobky znova prilejeme vodu, opakujeme až kým nezískame čistý supernatant. Po poslednom vyliatí supernatantu nám ostane sediment s trochou vody, ktorý kruhovitým pohybom mierne zamiešame, vylejeme na hodinové sklíčko a vyšetrujeme pod mikroskopom.
3. Larvoskopické metódy
Táto metóda sa využíva najmä na diagnostiku lariev pľúcnych červov (prežúvavcov, koní, mäsožravcov a králikov) a nematódov tráviaceho traktu. Trus na vyšetrenie musí byť čerstvý. Larvoskopické metódy využívajú fenomén termo a hydro tropizmu, t.j. aktívnej migrácie larvičiek z pevného chladného, alebo vysychajúceho prostredia do teplejšieho a vlhkého.
Vyšetrované zvieratá: mäsožravce (psy, mačky a iné), prežúvavce – malé (kozy, ovce) a veľké prežúvavce (hovädzí dobytok a vysoká lesná zver), kone, králiky
Vyšetrované parazity: pľúcne červy helmintov
Vajdova larvoskopická metóda – sa používa na vyšetrenie formovaného trusu oviec, kôz, srnčej a danielej zveri, králikov a pod.
Postup: na hodinové sklíčko položíme malé sitko s gázou a kúskami formovaného trusu, ktorý podlejeme asi 40 °C vodou tak, aby tretina trusu nebola pod vodou, a necháme stáť asi 15 minút. Po uplynutí tejto doby sitko s trusom odstránime a vzorku s hodinovým sklíčkom vyšetrujeme pod mikroskopom.
Baermanova larvoskopická metóda – používa sa na vyšetrenie fekálií napr. hovädzieho dobytka, koní, mäsožravcov
Postup: Použijeme jednoduchú aparatúru zloženú zo stojana s držiakom na sklenený lievik a na jeho koniec upevníme 10-15 cm dlhá gumenú hadičku, jej voľný koniec fixujeme tlačkou. Pod hadičku položíme hodinové sklíčko. Do lievika položíme sitko a 10-20 g trusu zabaleného do gázy. Po stenách lievika nalejeme 40 °C teplú vodu tak, aby jej hladina nepresahovala stred vzorky. Necháme stať 16-20 hodín počas ktorých larvičky migrujú do teplej vody a vlastnou hmotnosťou klesajú nad tlačku v gumenej hadičke. Po uplynutí danej doby uvoľníme tlačku a zachytíme niekoľko ml na hodinové sklíčko a prezeráme pod mikroskopom.
Pridaním kvapky Lugolovho roztoku pohyblivé a živé larvičky usmrtíme, môžeme preniesť pipetou na podložné sklíčko a presne diagnostikovať.